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上海生科院建立快速分析致死基因在不同組織中功能的新方法

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上海生科院建立快速分析致死基因在不同組織中功能的新方法

摘要: 　　4月21日，國(guó)際期刊細(xì)胞學(xué)習(xí)（Cell Research）以Article的形式發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)習(xí)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)學(xué)習(xí)所李勁松學(xué)習(xí)組和神經(jīng)科學(xué)學(xué)習(xí)所于翔學(xué)習(xí)組的最新學(xué)習(xí)成果：CRISPR-Cas9-mediated geno ...

　　4月21日，國(guó)際期刊細(xì)胞學(xué)習(xí)（Cell Research）以Article的形式發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)習(xí)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)學(xué)習(xí)所李勁松學(xué)習(xí)組和神經(jīng)科學(xué)學(xué)習(xí)所于翔學(xué)習(xí)組的最新學(xué)習(xí)成果：CRISPR-Cas9-mediated genome editing in one blastomere of two-cell embryos reveals a novel Tet3 function in regulating neocortical development，該學(xué)習(xí)利用CRISPR/Cas9技術(shù)和細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)對(duì)小鼠兩細(xì)胞胚胎中的單個(gè)卵裂球進(jìn)行了基因敲除，一步法獲得了Tet3基因敲除的健康嵌合小鼠，并對(duì)Tet3基因敲除后大腦皮層和海馬神經(jīng)元的突觸傳遞進(jìn)行了探究。該方法是一種快速地分析致死基因在各個(gè)組織器官中功能的新方法。
　　DNA雙加氧酶Tet3是Tet蛋白家族的一個(gè)重要成員，之前的學(xué)習(xí)發(fā)現(xiàn)，Tet3全身性敲除小鼠有局部可以發(fā)育到出生，但是出生后24小時(shí)內(nèi)死亡。因此，若想學(xué)習(xí)Tet3在成年小鼠中的功能，需要借助Cre/loxP系統(tǒng)在不同的組織中進(jìn)行特異性的敲除。這就帶來(lái)一系列的問題：待學(xué)習(xí)的組織是否有特異性的Cre小鼠資源；若想在不同組織中學(xué)習(xí)基因的功能，則需要不同的Cre小鼠；條件性敲除小鼠交配周期長(zhǎng)。
　　基于此，李勁松團(tuán)隊(duì)提出了一種基于嵌合體的快速分析致死基因潛在功能的方法。首先，他們?cè)趍T/mG小鼠胚胎的一細(xì)胞時(shí)期（受精卵時(shí)期）注射了Cas9 mRNA，而后在兩細(xì)胞時(shí)期，隨機(jī)地在兩細(xì)胞的其中一個(gè)卵裂球注射Cre mRNA和Tet3 sgRNAs。將這些注射過的胚胎移植到假孕小鼠體內(nèi)，就可以獲得Tet3敲除的嵌合鼠，這些嵌合鼠可以正常成活，并且在各個(gè)組織器官中都有紅色/綠色兩種細(xì)胞存在，其中紅色細(xì)胞是野生型，綠色細(xì)胞是Tet3敲除的。為簡(jiǎn)化基因型鑒定同時(shí)為保證敲除的成功率，學(xué)習(xí)人員進(jìn)一步將多個(gè)sgNRAs（3-4個(gè)）注射到單個(gè)卵裂球中，這種策略得到的小鼠很容易通過PCR條帶鑒定出是否有大片段敲除，同時(shí)可以把一整個(gè)外顯子刪除掉保證了敲除的成功率。他們對(duì)這些嵌合體小鼠的大腦進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Tet3敲除并不影響大腦皮層主要細(xì)胞類型的發(fā)育和分化。學(xué)習(xí)人員進(jìn)一步通過對(duì)鄰近的野生型和Tet3敲除細(xì)胞進(jìn)行成對(duì)電生理記錄，發(fā)現(xiàn)Tet3敲除之后，小鼠大腦皮層和海馬錐體神經(jīng)元的興奮性與抑制性突觸傳遞均發(fā)生了顯著性的改變，表現(xiàn)為興奮性突觸傳遞的上調(diào)和抑制性突觸傳遞的下調(diào)。學(xué)習(xí)結(jié)果提示Tet3在大腦不同腦區(qū)神經(jīng)環(huán)路的發(fā)育中起到了重要的作用。
　　該技術(shù)方法的優(yōu)越性主要在于：對(duì)于致死基因，可以一步法獲得嵌合小鼠，用于探究該基因在不同組織器官中的作用；在同一個(gè)個(gè)體內(nèi)，野生型細(xì)胞是基因敲除型細(xì)胞的嚴(yán)格對(duì)照；基因敲除型細(xì)胞可以零星地散布在各個(gè)組織中，有助于學(xué)習(xí)基因的自主性和非自主性功能。
　　李勁松組博士生汪凌波和于翔組博士生李敏寅為該論文的共同第一作者。學(xué)習(xí)員徐國(guó)良、景乃禾、黃超蘭等以及細(xì)胞平臺(tái)提供了支持和幫助。該論文得到了中科院、國(guó)家科技部及國(guó)家自然科學(xué)基金委的經(jīng)費(fèi)支持。
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