丁二酸是一種優(yōu)秀的平臺(tái)化合物，在化工、材料、醫(yī)藥、食品領(lǐng)域有著廣泛的用途，被美國能源部列為未來12種最有價(jià)值的平臺(tái)化合物之一。作為C4平臺(tái)化合物，丁二酸可用于合成1,4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯以及生物可降解材料聚丁二酸丁二醇酯（PBS）。構(gòu)建高效生產(chǎn)丁二酸的微生物細(xì)胞工廠，將可再生的生物質(zhì)資源高效轉(zhuǎn)化為丁二酸，是近年來國際上的研究熱點(diǎn)。糖酸轉(zhuǎn)化率和耐滲透脅迫是丁二酸細(xì)胞工廠改造的兩個(gè)重要方面。

　　中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員張學(xué)禮帶領(lǐng)的微生物代謝工程研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)前期研究表明，使用C5磷酸戊糖途徑替代C6糖酵解途徑，能提高葡萄糖代謝的還原力供給，解決丁二酸合成途徑中的還原力不平衡問題。通過增強(qiáng)磷酸戊糖途徑中的轉(zhuǎn)酮酶活性，并結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶的激活，可以將丁二酸的糖酸轉(zhuǎn)化率從1.1提高到1.3 mol/mol。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)大腸桿菌的磷酸戊糖途徑進(jìn)行了系統(tǒng)改造。通過使用啟動(dòng)子文庫對(duì)磷酸戊糖途徑7個(gè)基因進(jìn)行精確調(diào)控，解析了各個(gè)蛋白活性和丁二酸轉(zhuǎn)化率之間的相互關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，5-磷酸核糖異構(gòu)酶和5-磷酸核酮糖異構(gòu)酶是途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，這兩個(gè)酶活性的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致中間代謝物的不平衡，降低丁二酸的生產(chǎn)；其余5個(gè)蛋白活性在一定范圍內(nèi)和丁二酸轉(zhuǎn)化率呈正相關(guān)關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，將磷酸戊糖途徑分為三個(gè)模塊，并使用多維度模塊化代謝工程的策略對(duì)磷酸戊糖途徑進(jìn)行系統(tǒng)改造。最終，研究人員將丁二酸的轉(zhuǎn)化率提高到1.61 mol/mol，達(dá)到理論最大值的94%。相關(guān)研究成果發(fā)表在Biotechnology for Biofuels期刊上，天津工生所的博士研究生譚在高和陳晶為論文的共同第一作者。

　　另一方面，研究團(tuán)隊(duì)前期獲得一個(gè)高效的丁二酸細(xì)胞工廠HX024，該菌具有很強(qiáng)的耐滲透脅迫能力。在此基礎(chǔ)上，通過基因組重測序和反向代謝工程驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)關(guān)鍵蛋白CusS和RpoB的突變與菌株的耐滲透脅迫相關(guān)，并進(jìn)一步解析了其機(jī)理。Cu是細(xì)菌生長必不可少的微量金屬離子，然而，Cu(I)具有潛在的毒性，在厭氧條件下Cu(I)對(duì)Fe-S簇生物合成機(jī)器和含F(xiàn)e-S簇的重要代謝酶具有很大的破壞性，導(dǎo)致細(xì)胞在生理和代謝層次的全局紊亂。高滲透脅迫造成胞內(nèi)Cu(I)的積累。CusS蛋白突變（G210V）激活了cusCFBA基因簇的表達(dá)，使得細(xì)胞能更有效地外排Cu(I)，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐滲透脅迫能力。另外，通過外源添加Cu(I)螯合劑甲硫氨酸或半胱氨酸，也能提高大腸桿菌的耐滲透脅迫能力。該研究首次發(fā)現(xiàn)含硫氨基酸可作為厭氧條件下的耐滲透保護(hù)物質(zhì)。相關(guān)研究成果發(fā)表在Applied and Environmental Microbiology期刊上，天津工生所博士研究生肖孟雍為論文的第一作者。

　　基因rpoB編碼RNA聚合酶的β亞基，該基因突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的全局調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，RpoB突變（D654Y）導(dǎo)致在正常滲透壓條件下，谷氨酸代謝合成、滲透保護(hù)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ProU等與耐滲透脅迫相關(guān)的基因被激活，從而使大腸桿菌獲得了“預(yù)先應(yīng)對(duì)”機(jī)制，有利于細(xì)胞應(yīng)對(duì)即將到來的高滲透脅迫。在高滲條件下，該突變激活了一系列糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中麥芽糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因malEFGKM和lamB的表達(dá)水平提高最顯著（10-14倍）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高滲脅迫下增強(qiáng)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)可增強(qiáng)細(xì)胞的耐高滲能力。相關(guān)研究成果發(fā)表在BMC Biotechnology期刊上，天津工生所博士研究生肖孟雍為論文的第一作者。

　　上述研究得到國家自然科學(xué)基金、973計(jì)劃和中科院重點(diǎn)部署項(xiàng)目的支持。