PCR產(chǎn)物可以直接用來做雙酶切嗎？PCR產(chǎn)物做雙酶切有的片段很好切，有的片段很難切，這主要和PCR片段的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)。如果雙酶切很難切，就把整個片段分部分片段擴(kuò)增后，用單酶切。如果酶切位點(diǎn)在PCR產(chǎn)物的兩端，PCR產(chǎn)物酶切后很難判斷是否切開，以至影響下一步的連接轉(zhuǎn)化，如果一次成功沒的說,如果多次失敗,建議先回收加A連T載體轉(zhuǎn)化，再提質(zhì)粒作酶切，再連你的質(zhì)粒，步步為營。
也就是說，在對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切時，需要對PCR產(chǎn)物先進(jìn)行純化，PCR體系的離子會干擾酶切反應(yīng)。一般就是PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收下。 雙酶切還是單酶切看兩個酶的反應(yīng)Buffer是不是一致，一致就可以雙酶切了，30ul體系，酶1ul（大約10u），質(zhì)粒一定要純化，不然不能完全酶切，轉(zhuǎn)化出來都是原來的載體。PCR產(chǎn)物雙酶切 |
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