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由于表皮蠟質(zhì)覆蓋，大多數(shù)陸生植物的外觀呈蠟質(zhì)和白霜狀，蠟的損失可能會(huì)導(dǎo)致光澤的表型，對于葉菜是個(gè)有利的性狀。因此，鑒定表皮蠟質(zhì)缺乏的植物并闡明控制表皮蠟質(zhì)生物合成的調(diào)控機(jī)制將有利于農(nóng)作物改良。河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所&鄭州大學(xué)農(nóng)學(xué)院于《Theoretical and Applied Genetics》（5.699/Q1）發(fā)表文章《BrWAX2 plays an essential role in cuticular wax biosynthesis in Chinese cabbage (Brassica rapa L. ssp. pekinensis)》，將有助于更全面地了解植物角質(zhì)層蠟代謝網(wǎng)絡(luò)，并有助于加速培育具有鮮明綠色特征的油菜品種。 奧維森提供了轉(zhuǎn)錄組測序及分析服務(wù)。
研究背景覆蓋在植物表面的角質(zhì)層蠟在保護(hù)植物免受生物和非生物脅迫方面起著各種各樣的作用。無蠟突變體莖葉表面具有光澤，在豐富大白菜種質(zhì)資源、選育亮綠品種方面具有重要作用。然而，有關(guān)大白菜光澤性狀的基因卻鮮有報(bào)道。 研究方法植物材料： 親本：蠟質(zhì)雙單倍體品系R16-11（P1）和光澤自交大白菜品系Y1211-1（P2） 子代：F1、F2、BC1P1和BC1P2（BC1P1和BC1P2分別由F1與R16-11和Y1211-1回交獲得） 18種有光澤的蕓苔材料（11種菜心和7種大白菜）和10種蠟質(zhì)大白菜材料 方法： RNA-seq、BSA-seq、qRT-PCR
研究結(jié)果（1） Y1211-1的光澤性狀是由單基因隱性基因控制 R16-11所有氣生器官表面，如花序莖（圖1a）、花序葉（圖1b）、種子、花芽等均被蠟覆蓋。相比之下，Y1211-1對應(yīng)器官的外觀（圖1d、e）則趨向于光滑的綠色。用低溫掃描電鏡（Cryo-SEM）檢測了花序葉片蠟晶密度，發(fā)現(xiàn)R16-11的葉片表面覆蓋著大量蠟晶，主要為棒狀和板狀（圖1c）。而Y1211-1的葉片僅被少量蠟晶覆蓋（圖1f），說明Y1211-1的光滑表型是由蠟晶減少引起的。
圖1 兩個(gè)親本（R16-11和Y1211-1）表皮蠟質(zhì)的表型特征
在F1群體中，所有個(gè)體都表現(xiàn)出蠟質(zhì)表型，R16-11也是如此。F2和BC1P2群體存在表型分離現(xiàn)象。F2小群體蠟質(zhì)和光澤個(gè)體數(shù)分別為148個(gè)和52個(gè)，分離比為3:1，F(xiàn)2大群體的分離比也為3:1。BC1P2種群中蠟質(zhì)和有光澤個(gè)體數(shù)量分別為526和494，比例為1:1。200株BC1P1植株外觀均呈蠟狀。這些結(jié)果表明，Y1211-1的光澤表型是由一個(gè)單基因隱性基因控制的（表1）。我們將該位點(diǎn)命名為BrWAX2。
表1 R16-11與Y1211-1雜交后代光澤性狀的遺傳分析 （2）在有光澤的植物中，表皮蠟的產(chǎn)生會(huì)發(fā)生改變 為研究光澤的表型是否與蠟晶明顯減少有關(guān)，通過GC-MS檢查了W-bulk和G-bulk葉子的表皮蠟的含量和組成。與蠟質(zhì)植物相比，光澤葉片上的總蠟量減少了46.6%。G-bulk中烷烴和醛的總含量分別下降了79.7%和95.3%。G-bulk中的醛類總含量大約是W-bulk中的2.86倍。C29烷烴（壬烷）和C30醛（三十烷），分別占W-bulk和G-bulk中總蠟量的約59.2%和55.6%。然而G-bulk中C29烷烴含量降低了83.7%，C30醛含量增加了約3.4倍。結(jié)果表明，Y1211-1中有光澤的表型是由于蠟含量減少，尤其是烷烴含量減少造成的。
圖2 W-bulk和G-bulk葉片中的角質(zhì)層蠟成分
（3）BrWAX2基因的精細(xì)定位 為了初步定位BrWAX2基因，對W-pool和G-pool進(jìn)行BSA-Seq分析。在染色體A09上以95%的置信水平識(shí)別出一個(gè)從37.35到38.88 Mb的1.53 Mb候選區(qū)域。W-pool的平均SNP指數(shù)為0.60，而相應(yīng)區(qū)域G-pool的平均SNP指數(shù)為0.11。結(jié)果表明，該基因組區(qū)間存在一個(gè)主基因，這與Y1211-1的光澤性狀由一個(gè)隱性核基因控制的假設(shè)一致。 基于BSA-Seq分析，在候選區(qū)域建立了30個(gè)KASP標(biāo)記，用于篩選兩個(gè)親本，12個(gè)KASP標(biāo)記表現(xiàn)出良好的多態(tài)性。BrWAX2位點(diǎn)與LF2-K24和LF2-K17的遺傳距離分別為0.5和0.1 cM，遺傳圖譜中標(biāo)記的順序與物理圖譜中的順序一致（圖3a）。 使用flanking標(biāo)記（LF2-K8和LF2-K30）篩選了967個(gè)有光澤的F2植物，并鑒定了90個(gè)重組體（圖3b）。標(biāo)記LF2-K30與BrWAX2基因共分離，所有90個(gè)重組體均被標(biāo)記LF2-K8篩選出來，BrWAX2基因限定在標(biāo)記LF2-K36和染色體A09末端之間的100.78 kb間隔。![]() 圖3 大白菜BrWAX2基因的初步和精細(xì)定位
（4）候選基因分析 基于BrWAX2的精細(xì)定位結(jié)果，在Brassica數(shù)據(jù)庫中分析了100.78kb間隔內(nèi)的DNA序列，并對擬南芥進(jìn)行了比較基因注釋。結(jié)果顯示，在作圖區(qū)域識(shí)別出20個(gè)注釋或預(yù)測基因（表2）。對來自BRAD的這20個(gè)基因的注釋分析表明，只有一個(gè)名為Bra032670的基因可能是候選基因，該基因與擬南芥中的CER1同源。CER1編碼一種醛脫羧酶，在角質(zhì)層蠟生物合成過程中催化C30醛轉(zhuǎn)化為C29烷烴。
表2 BrWAX2位點(diǎn)候選區(qū)間的注釋基因![]()
通過半定量RT-PCR和qRT-PCR來檢測Bra032670在兩個(gè)親本不同組織中的表達(dá)情況。Bra032670在Y1211-1中的八種組織中均未轉(zhuǎn)錄（圖4a）。相比之下，在R16-11中的莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊表達(dá)要高得多。RNA-Seq分析顯示Bra032670是差異最顯著的基因，其在光滑莖中的表達(dá)水平約為蠟莖的13000倍（圖4e）。結(jié)果表明Bra032670基因是BrWAX2最可能的候選基因。 為了鑒定候選基因在親本系中的序列，使用引物BrWAX2-g1對Bra032670的基因組序列和編碼序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序。使用gDNA或cDNA作為模板從Y1211-1中沒有獲得擴(kuò)增產(chǎn)物（圖4b），推測在Y1211-1中缺少Bra032670基因。W-bulk中比對到Bra032670基因的BSA-Seq讀數(shù)的數(shù)量為325，而G-bulk中只有56個(gè)（圖4c）。Bra032670的平均BSA-Seq深度在W-bulk中為11.05，而在G-bulk中僅為1.70（圖4d）。3個(gè)G-bulk重復(fù)中，Bra032670的RNA-Seq讀數(shù)僅為1.01，相比之下，Bra032670在三個(gè)W-bulk的平均表達(dá)讀計(jì)數(shù)高達(dá)13,532.12（圖4e）。這些高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，Bra032670基因在Y1211-1中缺失。
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圖4 BrWAX2候選基因分析 （5）蠟質(zhì)和光澤莖的轉(zhuǎn)錄組分析 在W-bulk和G-bulk之間共檢測到1399個(gè)DEGs。KEGG富集分析表明，角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟的生物合成、次生代謝物的生物合成和代謝途徑是顯著富集的途徑（圖5a），并且這些途徑中的大多數(shù)基因在G-bulk中的表達(dá)水平較低，與光澤植物中蠟含量的降低一致。 與W-bulk相比，G-bulk中參與蠟生物合成的烷烴形成途徑的基因如CER1（Bra032670）、CER3（Bra006802）和MAH1（Bra027906）顯著下調(diào)，表明烷烴形成途徑在G-bulk中受到抑制。參與角質(zhì)層蠟轉(zhuǎn)運(yùn)的基因ABCG12（Bra031249）在G-bulk中上調(diào)。參與調(diào)節(jié)角質(zhì)和蠟生物合成的基因WIN1（Bra026140）上調(diào)，而MYB96（Bra035893）和MYB96（Bra010085）在G-bulk中下調(diào)。此外，參與角質(zhì)生物合成的基因，例如CYP77A6（Bra029852）、CYP86A4（Bra032642）和HTH（Bra003862），在G-bulk中顯著上調(diào)（圖5b）。進(jìn)一步對蠟代謝相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，與RNA-Seq結(jié)果一致（圖6）。![]() 圖5 蠟質(zhì)和光滑莖的轉(zhuǎn)錄組分析![]() 圖6 用qRT-PCR驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)的表達(dá) 研究結(jié)論本研究確定了大白菜表皮蠟生物合成的BrWAX2基因。采用BSA-Seq和通過KASP分析的連鎖分析將BrWAX2基因定位到100.78 kb的區(qū)間。RNA-seq功能注釋分析、表達(dá)分析和序列變異分析表明，編碼醛脫羧酶的Bra032670是BrWAX2最可能的候選基因。BrWAX2的缺失，以及烷烴形成途徑中其他基因表達(dá)的降低，減少了蠟的數(shù)量，并導(dǎo)致了光澤表型。
轉(zhuǎn)錄組揭示大白菜表皮蠟質(zhì)的生物合成基因 | 
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