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美捷登Rocia 在過去的二十幾年的時(shí)間里，對miRNA的研究呈現(xiàn)爆炸式的增長，miRNA從“生物垃圾”搖身一變成為“年度分子”，該領(lǐng)域的研究也成為近期最熱門的生物學(xué)課題之一。研究miRNA，經(jīng)常會涉及到miRNA和下游靶向基因互作，今天我們就為大家介紹一種常用于研究miRNA和下游靶向基因互作的技術(shù)——雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。
雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)原理
利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，在螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase）的上游的3’UTR區(qū)域插入待驗(yàn)證的靶序列，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。
海腎熒光素酶（Renilla luciferase或R-Luc）以腔腸素（coelenterazine）為底物，在氧分子存在的條件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide，此過程中發(fā)出最強(qiáng)波長在465nm左右的生物熒光。R-Luc通常由固定組成型啟動子驅(qū)動，在報(bào)告系統(tǒng)中作為校正input誤差的內(nèi)參信號。
在測量過程中，首先加入熒光素酶檢測試劑Luciferase Assay Reagent II產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，測量螢火蟲熒光素酶活性。定量螢火蟲熒光強(qiáng)度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo Reagent試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時(shí)啟動海腎熒光素酶反應(yīng)，進(jìn)行第二次測量，稱之為雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。
研究miRNA的靶基因?qū)嶒?yàn)時(shí)，使用雙熒光素酶質(zhì)粒情況
兩種熒光素酶分別位于兩個(gè)載體上，一般會涉及到三種質(zhì)粒：
報(bào)告基因質(zhì)粒：用于插入miRNA靶序列
內(nèi)參質(zhì)粒：表達(dá)海腎熒光素酶
轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒：micRNA
兩種熒光素酶位于同一個(gè)載體上, 現(xiàn)在的這類質(zhì)粒比較有名的是Promega公司的pmirGLO質(zhì)粒（見圖1）。從圖中可以看到海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶在同一個(gè)載體上。
圖1. pmirGLO 載體 案例分享 題目：Loss of miR-26b-5p promotes gastric cancer progression via miR-26b-5p-PDE4B/CDK8-STAT3 feedback loop
期刊： Journal of Translational Medicine 1479-5876 7.4
實(shí)驗(yàn)?zāi)康? miR-26b-5p與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶8（CDK8）或磷酸二酯酶4B（PDE4B）之間的相關(guān)性
實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果
1）構(gòu)建質(zhì)粒
報(bào)告基因質(zhì)粒：它用來插入miRNA靶序列，將野生型（WT）或者突變(MUT) CDK8/PDE4B 3’UTR序列克隆到pmirGLO載體中
轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒：miR-26b-5p 或NC
2）共轉(zhuǎn)染。將上述質(zhì)粒使用Lipofectamine™ 3000轉(zhuǎn)染到HEK-293 T細(xì)胞。
圖2. 共轉(zhuǎn)miR-26b-5p或者對照和3′UTR-WT或3′UTR-MUT的雙熒光素酶結(jié)果 3）檢測。當(dāng)miR-26b-5p在HEK-293 T細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，3′UTR-WT的熒光素酶活性測定顯著降低，而對3′UTR-MUT的熒光素酶活性沒有觀察到顯著影響
參考文獻(xiàn)：
Xu T, Xie M, Jing X, Jiang H, Wu X, Wang X, Shu Y. Loss of miR-26b-5p promotes gastric cancer progression via miR-26b-5p-PDE4B/CDK8-STAT3 feedback loop. J Transl Med. 2023 Feb 3;21(1):77. doi: 10.1186/s12967-023-03933-x. PMID: 36737782; PMCID: PMC9898947.
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